Без рубрики

Использование метода детекции клеток плода в крови беременных женщин в целях пренатальной диагностики хромосомных аберраций

УТВЕРЖДАЮ

Заместитель председателя Комитета здравоохранения И.А. Лешкевич 9 декабря 2000 года

СОГЛАСОВАНО

Главный медицинский генетик Комитета здравоохранения Г.Г. Гузеев 9 декабря 2000 года

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ДЕТЕКЦИИ КЛЕТОК ПЛОДА В КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН В ЦЕЛЯХ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ

(Информационное письмо N 21)

Председатель УМС Комитета здравоохранения Л.Г. Костомарова 8 декабря 2000 года

Учреждение-разработчик: Медико-генетический научный центр РАМН.
Составители: д.б.н. Т.В. Золотухина, к.м.н. Н.В. Шилова, к.б.н. И.А. Замулаева.
Предназначение: для использования в учреждениях, специализирующихся на пренатальной диагностике и профилактике врожденных и наследственных заболеваний.

Новый неинвазивный подход в пренатальной диагностике хромосомных анеуплоидий базируется на возможности исследования клеток плода, выделенных из крови беременных женщин. Феномен трансплацентарной трансфузии различных клеток плода в периферическую кровь беременных женщин позволяет подойти к проблеме пренатальной диагностики хромосомных нарушений у плода без проведения инвазивных процедур.
В связи с очень низкой концентрацией клеток плода в крови матери необходимо использование биотехнологических этапов их обогащения, сортировки (или сепарации) и высокоспецифичного анализа. На основании результатов проведенного исследования составлена настоящая инструкция по обогащению и детекции клеток плода с помощью методов сортировки и последующего FISH-анализа сортированных клеток с использованием хромосомо-специфичных ДНК-зондов на хромосомы наиболее частых трисомий у человека. Объектом сортировки последующего анализа были эритробласты плода, не сохраняющиеся в организме матери от плодов предыдущих беременностей.
С согласия пациенток 10-25 мл периферической венозной крови из локтевой вены забирали в стерильный флакон (Nunc), содержащий в качестве антикоагулянта 1-2 мл раствора гепарина (Richter) в растворе фосфатно-солевого буфера (0,01М PBS, pH 7,2) в соотношении 1:20. В случаях когда проводилась пренатальная цитогенетическая диагностика, венозную кровь у женщин брали спустя 5-7 дней после инвазивной процедуры. Обычно полученные образцы крови до последующей обработки хранили при комнатной температуре в пределах 24 часов.

Методы обогащения материнской крови плодными клетками

Для обогащения материнской крови клетками плода проводили центрифугирование образцов в градиенте плотности фиколла с целью выделения фракции мононуклеарных клеток. При этом нативную венозную кровь разводили 0,01М раствором PBS (pH 7,2) в соотношении 1:1, наслаивали на Ficoll Paque (Pharmacia Biotech) или фикол-верографин (Панэко) с плотностью 1,077 г/куб. см в соотношении 2:1 и центрифугировали в градиенте плотности при 400 g 30 минут на центрифуге К-70. Фракцию мононуклеарных клеток отбирали пастеровской пипеткой, отмывали дважды в 0,01М растворе PBS, центрифугируя при 1500 об./мин. 15 минут на центрифуге ОПн-3. Концентрацию ядерных клеток в 1 мл крови определяли в камере Горяева.

Детекция эритробластов плода

В зависимости от последующих методов изоляции плодных эритробластов процедуры детекции отличались друг от друга.
 При использовании флуоресцентно-активированной клеточной сортировки(ФАКС) осадок выделенных мононуклеарных клеток ресуспензировали в 0,01Мрастворе PBS с 0,5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) и подвергалипрямому флуоресцентному окрашиванию с помощью моноклональных антител кповерхностным антигенам нормобластов: к гликофорину А, меченныхфикоэритрином (PE) (GPA + PE, клон D2.10, Coulter), из расчета 10 мкл на 71 x 10 ядерных клеток и к трансферрину, меченных изотиацианатомфлуоресцеина (FITC) (CD71 + FITC, Becton Dickinson), из расчета 20 мкл 7на 1 x 10 ядерных клеток. При отрицательной сортировке использовалимоноклональные антитела к поверхностным антигенам лимфоцитов (CD45 + FITC, 7Becton Dickinson) из расчета 20 мкл на 1 x 10 ядерных клеток. Клеткиинкубировали 1 час в темноте при комнатной температуре, центрифугировалипри 3000 об./мин. 5 минут, осадок клеток ресуспендировали в 0,01М раствореPBS, центрифугировали при 3000 об./мин. 5 минут и полученный клеточныйосадок фиксировали в 1 мл 1% раствора формальдегида в PBS. Образцы донепосредственной клеточной сортировки хранили при +4 °C. Для прокрашиванияДНК за 20 минут до анализа к клеткам добавляли Hoechst 33342 (Sigma)в конечной концентрации 10 мкг/мл.
При магнитно-активированной клеточной сортировке (МАКС) использовали моноклональные антитела, связанные с магнитными носителями. Сортировку клеток проводили в магнитном поле. Иммуномагнитные шарики предварительно отмывали в растворе PBS с 0,2% БСА в соотношении 1:20 с последующим разделением магнитных шариков и буферного раствора на кобальто-самариевом магнитном носителе (Immunotech) в течение 5 минут. Суспензию клеток с иммуномагнитными шариками инкубировали при комнатной температуре 10 мин., осторожно перемешивая после 5 мин. инкубации.

Флуоресцентно-активированная клеточная сортировка (ФАКС)

Образцы анализировали на проточном цитофлуориметре-сортировщике FACS Vantage (Becton Dickinson) не позднее чем через 24 часа после окрашивания. Проточный цитофлюориметр был оборудован лазером (Enterprise 621, Coherent Inc.) с эмиссией 2 волн: 364 нм (для возбуждения флюоресценции Hoechst 33342) и 488 нм (для возбуждения флюоресценции FITC и PE).
Анализ клеток проводили по 5 параметрам: интенсивность бокового и прямого светорассеяния, флюоресценции FITC, PE и Hoechst 33342. Для измерения флюоресценции FITC использовали узкополосные фильтры 530/30 нм, PE — 575/26 нм, Hoechst 33342 — 424/40 нм. Мощность лазера составляла 20 mW для пучка с длиной волны 364 нм и 100-120 mW для пучка с длиной волны 488 нм.
 Юстировку прибора проводили с помощью 2-мкм калибровочных шариков(Becton Dickinson), флюоресцирующих в диапазоне FITC и PE, а такжетимоцитов теленка (Becton Dickinson), окрашенных Hoechst 33342. Качествосортировки проверяли с помощью 6 мкм шариков, окрашенных различными 3флуорохромами. Анализ и сортировку проводили со скоростью 1,5-2,0 x 10кл/с с использованием программы Lysys II (Becton Dickinson). ФАКСпроводилась старшим научным сотрудником лаборатории пострадиационноговосстановления Медицинского радиологического научного центра РАМН к.б.н.Замулаевой И.А. (руководитель лаборатории - д.м.н., профессор Саенко А.С.).Отсортированные клетки наносили на ограниченные участки предметных стекол,обработанных 2% раствором 3-аминопропилтриэтоксисилана в ацетоне. В первойсерии образцов (с 1 по 14) на препараты с клетками наносили по 200 мкл0,05М раствора KC1 и инкубировали при 37 °C в течение 20 минут.Гипотонический раствор аккуратно сливали и наносили 200 мкл раствора,содержащего 30% фиксатора (метанол-уксусная кислота 3:1) и 70% 0,075Мраствора KC1, на 5 минут при комнатной температуре. Затем раствор аккуратносливали и на стекло наносили 1 мл свежеприготовленного фиксатора с высоты50-60 см. После удаления фиксатора стекла высушивали при 60 °C в течение5 минут и дегидратировали в 70, 80 и 96% этаноле. Во второй серии образцов(с 15 по 28) препараты с клетками инкубировали с 0,005% раствором пепсинав 0,01М растворе HC1 в течение 30 минут при 37 °C. Стекла промывалив растворе PBS при комнатной температуре в течение 5 минут с последующейфиксацией в 1% растворе формальдегида в растворе PBS в течение 5 минут.Затем в течение 5 минут стекла промывали в растворе PBS и дегидратировалив 70, 80 и 96% этаноле по 2 минуты в каждом.

Магнитно-активированная клеточная сортировка (МАКС)

Непосредственно после инкубации выделенных клеток с анти-CD45 иммуномагнитными шариками пробирку с клеточной суспензией помещали на кобальто-самариевый магнитный держатель на 10 минут. Не удаляя пробирку из магнитного поля, аккуратно переносили супернатант в чистую пробирку, которую повторно ставили на магнитный держатель на 10 минут. Супернатант собирали в чистую пробирку и наносили на ограниченные участки предварительно прогретых до 37 °C предметных стекол, покрытых 2% раствором 3-аминопропилтриэтоксисилана в ацетоне. На препараты с клетками наносили 200 мкл 0,05М раствора KC1 и инкубировали при 37 °C в течение 20 минут. Гипотонический раствор аккуратно сливали и наносили 200 мкл раствора, содержащего 30% фиксатора (метанол-уксусная кислота 3:1) и 70% 0,075М раствора KC1, на 5 минут при комнатной температуре. Затем раствор аккуратно сливали и на стекло наносили 1 мл свежеприготовленного фиксатора с высоты 50-60 см. После удаления фиксатора стекла высушивали при 60 °C в течение 5 минут с последующей дегидратацией в 70, 80 и 96% этаноле.

Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH)

Флюоресцентную in situ гибридизацию (FISH) проводили на препаратах с итерфазными ядрами клеток плода, полученных из цельной периферической крови беременных женщин при использовании различных методов клеточной сортировки и культивирования по методу Pinkel с соавторами (Pinkel et al., 1986), в модификации, разработанной в лаборатории цитогенетики человека под руководством проф., д.б.н. Юрова Ю.Б. (НЦ психического здоровья РАМН). Во всех случаях при регулярных трисомиях у плодов были использованы биотинилированные центромерные альфа-сателлитные ДНК-пробы MCG13.21-01 (13; 21cen), MCG18-01 (18cen), MCGX-01 (Xcen), сконструированные в лаборатории цитогенетики человека НЦ психического здоровья РАМН под руководством проф. Юрова Ю.Б. Описание этих последовательностей представлено в работах проф. Юрова Ю.Б. с соавторами (Юров, 1987, Юров и др., 1989, Yurov et al., 1997). В двух случаях, когда кариотипы плодов были 46,XY,-14,+t(14/21)mat и 46,XX,-21,+t(21/21), мы использовали биотинилированный PAC-клон, несущий хромосомо-21-специфичную однокопийную вставку на район 21q22.3, полученный в лаборатории проф. Юрова Ю.Б.
Кроме того, была использована биотинилированная ДНК-проба pY3.4, содержащая фрагмент длиной 3,4kb. из Hae III повторов гетерохроматинового района Y-хромосомы человека, сконструированная Dr. Lau Y.F. (University of California, San Francisco, CA).
При проведении FISH с альфа-сателлитными ДНК-зондами по 1 мкл альфа-сателлитных ДНК-проб разводили в 9 мкл гибридизационной смеси (55% формамид, 2 x SSC) до конечной концентрации 2 нг/мкл. Полученную смесь наносили на препараты с отсортированными клетками, предварительно обработанными различными способами в зависимости от метода детекции (пп. 2.3, 2.4, 2.5, 2.6), накрывали покровными стеклами размером 22 x 22 мм и прогревали при 78 °C в течение 7 минут для одновременной денатурации ДНК зонда и хромосом. Гибридизацию проводили во влажной темной камере при 37 °C в течение 16-18 часов. После удаления покровных стекол препараты отмывали в 50% формамиде, 2 x SSC при 42 °C в течение 15 минут, затем в 0,1 x SSC при 45° в течение 30 минут, однократно ополаскивали в 4 x SSC / 0,1% Triton X-100. На препараты наносили по 20 мкл авидина, меченного FITC (FITC-avidin "Vector") в концентрации 5 мкг/мл в 0,5% растворе бычьего сывороточного альбумина в 4 x SSC, накрывали покровными стеклами 22 x 22 мм и инкубировали во влажной камере 30 минут при 37 °C. Затем удаляли покровные стекла и отмывали препараты в трех сменах раствора 4 x SSC, 0,1% Triton Х-100 при 42 °C по 5 минут. Для усиления гибридизационного сигнала проводилась иммунологическая амплификация с биотинилированными антителами к авидину (Antiavidin "Vector"). Для этого на препараты наносили 20 мкл антиавидина в концентрации 5 мкг/мл в 0,5% растворе БСА в 4 x SSC, накрывали покровными стеклами размером 22 x 22 мм и инкубировали 30 минут при 37 °C во влажной камере. Затем покровные стекла удаляли и препараты отмывали в трех сменах раствора 4 x SSC / 0,1% Triton X-100 при 42 °C по 5 минут. Затем на препараты наносили по 20 мкл FINC-avidin в концентрации 5 мкг/мл, накрывали покровными стеклами размером 22 x 22 мм и инкубировали 30 минут при 37 °C во влажной камере. После удаления покровных стекол препараты отмывали в трех сменах раствора 4 x SSC, 0,1% Triton X-100 при 42 °C по 5 минут.
Для контрастирующего окрашивания ядер на препараты наносили 20 мкл смеси, состоящей из раствора йодистого пропидия в концентрации 200 нг/мл в фотозащитном растворе, содержащем противовыцветающий реагент — 2% 1,4-диазобицикло-[2.2.2]октан (DABCO) в 50% глицерине на 20мМ Tris-HCl (pH 8,0) и накрывали покровными стеклами 22 x 22 мм.
При проведении FISH с pY3.4 ДНК-зондом по 1 мкл ДНК-зонда разводили в 6 мкл гибридизационной смеси до конечной концентрации 2 нг/мкл. Полученную смесь наносили на препараты с изолированными и предварительно обработанными клетками в зависимости от способов детекции и накрывали покровными стеклами размером 22 x 22 мм. Одновременную денатурацию препаратов и ДНК-зонда проводили в течение 7 минут при 78 °C с последующей гибридизацией во влажной камере при 37 °C в течение 16-18 часов. После удаления покровных стекол препараты отмывали в 50% формамиде, 2 x SSC при 37 °C в течение 30 минут, затем в 2 x SSC при 37 °C 30 минут. Для детекции гибридизационного сигнала на препараты наносили FITC-avidin "Vector" в концентрации 5 мкг/мл, накрывали покровными стеклами размером 22 x 22 мм и инкубировали во влажной камере при 37 °C в течение 30 минут. Затем удаляли покровные стекла и отмывали препараты в трех сменах раствора 4 x SSC по 5 минут при 37 °C и однократно — в растворе PBS. Для окраски препаратов наносили по 20 мкл смеси, содержащей йодистый пропидий в концентрации 200 нг/мл в фотозащитном растворе и накрывали покровными стеклами размером 22 x 22 мм.
В случаях когда использовался однокопийный ДНК-зонд на теломерный участок хромосомы 21(21q22.3), проводили раздельную денатурацию ДНК выделенных клеток и ДНК-пробы.
Денатурацию препаратов с предварительно обработанными клетками проводили в 70% формамиде, 2 x SSC при 70 °C в течение 2 минут с последующей дегидратацией в серии спиртов 70° , 80° и 96° по 5 минут в каждом. 50 нг фаговой ДНК-пробы смешивали с 2 мкг Cot 1 человеческой ДНК (Gibco BRL) в 10 мкл гибридизационной смеси, содержащей 50% формамид, 2 x SSC, 10% декстрансульфат. Денатурацию ДНК-зонда в гибридизационной смеси осуществляли прогреванием в течение 5 минут при 100 °C на водяной бане. Гибридизационную смесь по 10 мкл наносили на препараты, накрывали покровными стеклами размером 22 x 22 мм и инкубировали во влажной камере при 37 °C в течение 16-18 часов. Постгибридизационная отмывка, детекция гибридизационного сигнала и иммунологическая амплификация проводились, как описано в п. 2.9.1.
Микроскопирование проводили на флуоресцентном микроскопе Opton Axioscop со светофильтром N 9 (длина волны 510 нм) для анализа флуоресценции FITC и на флуоресцентном микроскопе Jenalumar со светофильтрами "U-204" и "В-226" (длина волны 410 нм) для анализа флуоресценции Hoechst 33342. Фотографирование клеток осуществляли на пленку Kodak Ectachrome ASA 200.
В результате проведенного исследования получены результаты, свидетельствующие о возможности выделения, детекции и анализа клеток плода, присутствующих в крови беременных женщин.
Во всех образцах крови женщин, беременных плодами мужского пола, при использовании обоих методических подходов сортировки (ФАКС и МАКС), при последующем FISH-анализе с Y-хромосомо-специфичным ДНК-зондом были обнаружены эритробласты плода (Y + клетки) в среднем в 1,9% среди сортированных клеток.
Эти результаты позволили использовать данный метод для изоляции и анализа клеток плода при хромосомных анеуплоидиях, диагностированных у плода при проведении классической пренатальной цитогенетической диагностики.
Результаты FISH-анализа клеток плода, сортированных методом ФАКС из крови женщин, беременных плодами с хромосомными анеуплоидиями, убедительно свидетельствуют о том, что при использовании FISH-метода с соответствующими хромосомо-специфичными ДНК-зондами можно выявить аберрантные клетки плода в крови беременных женщин. Причем их концентрация в сортированных образцах была равна в среднем 4%, что статистически значимо выше, чем при беременности здоровым плодом (1,9%).
При сравнении качества сортированных клеток и результатов их последующего FISH-анализа можно сделать вывод, что более физиологичным, и поэтому более предпочтительным, является метод магнитно-активированной сортировки, поскольку позволяет получить для анализа неповрежденные, структурированные (менее травмированные) клетки. Такое качество сортированных клеток способствует более эффективной гибридизации при FISH-методе и, соответственно более корректному анализу гибридизационных сигналов с хромосомо-специфичными ДНК-зондами.
Новый неинвазивный метод пренатальной диагностики хромосомных анеуплоидий может быть использован как дополнительный или даже как альтернативный при невозможности проведения инвазивной диагностики.

Добавить комментарий